Mol Psychiatry︱生物钟基因Bmal1在自闭症及小脑共济失调的小鼠模型中的作用
撰文︱柳 栋
责编︱王思珍
生物昼夜节律（circadian rhythms）是多种生物中都存在的普遍现象。昼夜节律由生物钟（circadian clock）产生并在调控生物基因表达、神经活动和个体行为等诸多方面发挥重要作用。在细胞水平，生物钟由一组生物钟基因构成的转录-翻译反馈环路驱动。在哺乳动物中，BMAL1与CLOCK或者NPAS2蛋白形成二聚体调控节律性转录，Bmal1基因是唯一一个基因敲除后可以导致生物节律完全丧失的生物钟基因[1]。不仅如此，BMAL1还可以作为翻译因子调控蛋白质合成[2]。
自闭症谱系障碍（autism spectrum disorders，ASDs）是一种与大脑发育相关的疾病，它会影响一个人感知他人和社交的方式，带来社交和沟通方面的问题。这种疾病还包括有限和重复的行为模式。之前研究发现，在自闭症人群中多个生物钟基因出现功能丧失性基因突变（loss of function mutation）[3-5]。另外，激素昼夜节律紊乱和睡眠障碍是自闭症患者常见的表现。最近研究发现BMAL1是一个与人类社交行为有显著相关性的基因，自闭症患者中也发现显著的 Bmal1突变[5,6]。所有这些证据都提示Bmal1可能与自闭症的发生有关， 但是还没有实验证据可以证明这一点。
2022年3月17日， 美国明尼苏达大学医学院Ruifeng Cao教授和英国爱丁堡大学的Christos G. Gkogkas教授团队在Molecular Psychiatry上发表了题为“Autistic-like behavior and cerebellar dysfunction in Bmal1 mutant mice ameliorated by mTORC1 inhibition”的文章，首次揭示了Bmal1基因在自闭症发生及小脑共济失调中的作用机制， 这些研究支持生物钟基因表达紊乱在自闭症发生中可能发挥显著作用。
在这篇文章中，首先作者利用小鼠社交行为学检测方法，发现Bmal1敲除（KO）后，小鼠社交性（sociability）显著降低（图1a, b），嗅觉适应实验也同时证明Bmal1 KO小鼠对陌生小鼠的气味缺乏兴趣 （图1c）。同时，Bmal1 KO小鼠也表现出过度的的梳毛行为（grooming）（图1d），并且出现刻板的活动轨迹（图1e）。这些结果都支持Bmal1 KO小鼠表现出明显的自闭症相关的行为障碍。
图1 Bmal1敲除小鼠表现出自闭症行为特征
（图源：D Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
由于自闭症儿童经常同时出现运动功能的障碍，作者同时检测了Bmal1 KO小鼠的运动功能。 在Rotarod装置进行的训练中发现，Bmal1 KO小鼠表现出明显的运动学习能力下降以及运动协调功能障碍，提示有小脑共济失调的存在（图2a）。组织学研究显示，Bmal1 KO小鼠的小脑浦肯野细胞（Purkinje cells）密度增多并且较正常小鼠细胞形态更长（图2b），浦肯野细胞的树突棘也出现发育不良的形态并且密度更高（图2c）。这些结果表明Bmal1敲除导致小鼠小脑浦肯野细胞的形态和功能都受到明显影响。
图2 Bmal1敲除小鼠表现出运动学习障碍和小脑浦肯野神经元形态学改变
（图源：D Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
进一步的神经电生理研究显示，Bmal1 KO小鼠浦肯野细胞中记录到的兴奋性突触后电位（EPSC）幅度比正常增高2倍左右（图3c, d）。同时，抑制性突触后电位（IPSC）幅度也比正常升高2倍左右（图3e），但是兴奋性/抑制性电位比值（E﹕I ratio）并没有显著改变（图3f）。另外， 浦肯野细胞的自发放电频率都在Bmal1 KO后显著降低（图3g, h）。这些结果证明Bmal1 KO小鼠浦肯野细胞的电生理学特性的改变可能是造成Bmal1敲除后小脑功能障碍的机制。
图3 Bmal1敲除小鼠浦肯野神经元的电生理学改变
（图源：D Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
由于Bmal1能够调控蛋白质合成，作者进行了Bmal1敲KO小鼠和野生型小鼠小脑组织的Ribo-seq（核糖体印迹测序技术），通过分析发现304个差异翻译的基因（differentially translated genes，DTGs），其中12个基因为自闭症风险基因（SFARI genes）。另外， 信号通路分析发现很多DTGs位于eIF2信号和eIF4E-p70S6K信号通路中（图4a, b）。通过免疫组化和蛋白印记实验证实。mTORC1/S6K1和eIF2信号通路在敲除Bmal1后活性显著增强（图4c-e）。
图4 Bmal1 KO小鼠小脑翻译特征以及相关通路的改变
（图源：D Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
由于mTORC1信号通路在Bmal1 KO小鼠小脑中显著增强，研究显示一种糖尿病治疗的一线药物，二甲双胍（metformin）可以抑制 mTORC1的活性。基于这些数据，作者应用二甲双胍对Bmal1 KO小鼠进行了实验性治疗。作者惊喜的发现，二甲双胍显著抑制小脑中的mTORC1通路活性，并且显著改善了Bmal1 KO小鼠的社交障碍和重复行为（图5a-f）。电生理结果也显示，二甲双胍能提高Bmal1 KO小鼠浦肯野细胞的自发放电频率到正常水平（图5g）。
图5 Metformin能够改善Bmal1 KO小鼠自闭症相关行为以及抑制mTORC1通路
（图源：D Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
最后， 为了验证Bmal1在小脑浦肯野细胞中的表达是否在自闭症表型中起关键作用，作者建立了Bmal1浦肯野细胞条件性敲除小鼠 （Bmal1flx/flx:L7-Cre）。与对照Bmal1flx/flx小鼠相比， Bmal1flx/flx:L7-Cre小鼠也表现出社交障碍行为（social novelty deficits），重复行为显著增多，以及在Rotarod训练实验中运动协调能力的下降（图6a-d）。电生理方面，相比Bmal1flx/flx浦肯野细胞，Bmal1flx/flx:L7-Cre浦肯野细胞的EPSC和IPSC幅度都显著升高，自发放电频率都显著降低（图6f-h）。同时，Bmal1条件敲除后，浦肯野细胞的mTORC1通路活性明显增强（图6i）。浦肯野细胞的树突棘形态也显示出发育不良（图6j）。这些结果都表明Bmal1浦肯野细胞条件性敲除足以使小鼠呈现与Bmal1基因敲除小鼠类似的自闭症相关表现。
图6 Bmal1flx/flx:L7-Cre条件性敲除小鼠表现出自闭相关行为和改变
（图源：D Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
本研究发现在小鼠模型中全身或者仅在小脑浦肯野细胞中条件性敲除Bmal1都能够造成小鼠的自闭症相关症状，具体表现为社交活动的缺失以及重复行为的增加。此前研究发现，Bmal1敲除也会影响认知以及记忆功能[7, 8]，并且会导致星状胶质细胞增生[9]，这些表现也与临床观察到的部分ASD表现相符合[10,11]。同时，运动功能以及小脑在自闭症谱系障碍（ASD）发生中的作用也被广泛的关注和研究，特别是浦肯野细胞的作用尤其重要。在Bmal1敲除小鼠中，作者观察到了浦肯野细胞的形态以及功能学变化，进一步为浦肯野细胞在ASD发生中的作用提供依据。
尽管Bmal1全身敲除和浦肯野细胞条件性敲除对社交行为的影响略有不同，但是都显著影响浦肯野细胞的功能以及mTORC1信号通路的活性。不仅如此，通过应用之前在脆性X染色体综合征（Fragile X syndrome）中改善小鼠社交性的二甲双胍[12]，也再次研究的Bmal1基因敲除的自闭症社交障碍模型中发挥显著治疗作用。 此研究发现二甲双胍通过降低mTORC1的异常增高起作用， 因为二甲双胍是临床常用药， 这些结果提示二甲双胍可以被用于某些自闭症患者的治疗。
总体来说，这项研究首次证实了关键生物钟基因Bmal1在小鼠自闭症模型中的作用，提示生物钟基因表达异常可能在自闭症发生中起显著作用。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41380-022-01499-6
文章第一作者柳栋（左一），通讯作者Ruifeng Cao（左二）
（照片提供自Ruifeng Cao实验室）
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【1】Science︱小鼠快速眼动睡眠由基底外侧杏仁核多巴胺信号调节
【2】Nat Neurosci︱双相情感障碍患者杏仁核和前扣带回神经免疫和突触相关通路下调
【3】Nat Commun︱周小明/孙子宜团队根据Sigma-1受体开放式构象揭示其配体进入途径的分子机制
【4】Glia︱袁增强课题组揭示调控少突胶质前体细胞增殖新机制：c-Abl通过磷酸化Olig2
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【6】J Neuroinflammation︱顾小萍课题组揭示星形胶质细胞网络在长时程异氟烷麻醉介导的术后认知功能障碍中的重要作用
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【8】J Neurosci︱周强课题组揭示突触外NMDARs双向调控抑制性神经元内在兴奋性
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1. Bunger MK, Wilsbacher LD, Moran SM, Clendenin C, Radcliffe LA, Hogenesch JB, et al. Mop3 is an essential component of the master circadian pacemaker in mammals. Cell. 2000;103:1009–17.
2. Lipton JO, Yuan ED, Boyle LM, Ebrahimi-Fakhari D, Kwiatkowski E, Nathan A, et al. The Circadian protein BMAL1 regulates translation in response to S6K1-mediated phosphorylation. Cell. 2015;161:1138–51.
3. Nicholas B, Rudrasingham V, Nash S, Kirov G, Owen MJ, Wimpory DC. Association of Per1 and Npas2 with autistic disorder: support for the clock genes/social timing hypothesis. Mol Psychiatry. 2007;12:581–92.
4. Iossifov I, O’Roak BJ, Sanders SJ, Ronemus M, Krumm N, Levy D, et al. The contribution of de novo coding mutations to autism spectrum disorder. Nature. 2014;515:216–21.
5. Yang Z, Matsumoto A, Nakayama K, Jimbo EF, Kojima K, Nagata K, et al. Circadian- relevant genes are highly polymorphic in autism spectrum disorder patients. Brain Dev. 2016;38:91–99.
6. Bralten J, Mota NR, Klemann C, De Witte W, Laing E, Collier DA, et al. Genetic underpinnings of sociability in the general population. Neuropsychopharmacology.
2021;46:1627–34.
7. Wardlaw SM, Phan TX, Saraf A, Chen X, Storm DR. Genetic disruption of the core circadian clock impairs hippocampus-dependent memory. Learn Mem. 2014;21:417–23.8. Snider KH, Dziema H, Aten S, Loeser J, Norona FE, Hoyt K, et al. Modulation of learning and memory by the targeted deletion of the circadian clock gene Bmal1 in forebrain circuits. Behav Brain Res. 2016;308:222–35.
9. Musiek ES, Lim MM, Yang G, Bauer AQ, Qi L, Lee Y, et al. Circadian clock proteins regulate neuronal redox homeostasis and neurodegeneration. J Clin Invest. 2013;123:5389–5400.
10. Crawford JD, Chandley MJ, Szebeni K, Szebeni A, Waters B, Ordway GA. Elevated GFAP protein in anterior cingulate cortical white matter in males with autism spectrum disorder. Autism Res. 2015;8:649–57.11. Laurence JA, Fatemi SH. Glial fibrillary acidic protein is elevated in superior frontal, parietal and cerebellar cortices of autistic subjects. Cerebellum. 2005;4:206–10.
12. Gantois I, Khoutorsky A, Popic J, Aguilar-Valles A, Freemantle E, Cao R, et al. Metformin ameliorates core deficits in a mouse model of fragile X syndrome. Nat Med. 2017;23:674–7.
制版︱王思珍
本文完